Metoder
Hovedinnhold
Biobanking:
Vår lab har dannet en AML-biobank som inkluderer Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og benmarg (BM) i tillegg til serum og plasma fra de samme pasientene. Vi biobanker av og til prøver fra andre typer blodkreft i tillegg til AML.
I tillegg har vi biobanket pasientprøver fra andre sykdommer:
MDS (Serum, PBMC, og BM (lymfopreppet og fordelt i CD34 positive og negative celler vha. magnetiske kuler, i tillegg til cytospinn til mikroskopering)).
Sepsis (serum og plasma).
Dyp venøs trombose (serum og plasma).
Friske donorer (PBMC, afereseprodukt, navlestrengsblod, serum og plasma).
Labben vår deltar også med prosessering og nedfrysning av prøver til forskjellige kliniske studier: PROLONG studien (PBMC, serum, plasma, blod, feces), og en Kuldeagglutinerings studie, der all prosessering av serum og plasma-prøvene må utføres ved 39 °C før de fryses ned.
Cellekulturer:
Vi dyrker både primære celler og cellelinjer, alene og i kokulturer, ved normoxy og/eller hypoksi. Disse cellene benyttes i en rekke forsøk. For å nevne noen få eksempler ser vi på effekter av diverse medikamenter, cellenes evne til å danne kolonier, evaluering av cellesignalering, celledød, autofagi, celledifferensiering, proliferasjon (3H thymidin assay) og cellelokalisering (fluorescerende mikroskopi).
Flowcytometri:
De fleste flowcytometriforsøkene våre utføres på vårt eget FACS Verse flowcytometer, der vi kan se på opptil 8 farger om gangen, men vi har også samarbeid med AIT (avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin) og HVL, der deres instrumenter har blitt benyttet, i tillegg til instrumentene på kjernefasilitet for flowcytometri på instituttet. Denne metoden benytter vi i en rekke applikasjoner, som f.eks. kvantifisering av celler i blod, apoptose-assays, phosphosignalering, tilstedeværelse av spesifikke markører, ROS og autofagi etc. Vi benytter både cellelinjer og primære celler i dette arbeidet.
Luminex og ELISA:
S erum, plasma og supernatanter fra cellekulturer undersøkes kvantitativt for en rekke komponenter gjennom Luminex og ELISA analyser. Begge metodene bygger på antistoffbinding til analytter i prøvematerialet, som sammenliknes mot en standard av kjente verdier. På Luminex analyseres mange analytter samtidig for høy utnyttelse av prøvematerialet, mens ELISA har den fordelen at den lettere kan tilpasses spesielt høye eller lave verdier på enkelt analytter. For eksempel ser vi etter prognostiske markører i serum/plasma fra pasienter som responderer vs. pasienter som ikke responderer på behandling.
PCR, kvantitativ PCR (qPCR), microarray, sekvensering, og rensing av nukleinsyrer fra prøvemateriale:
V i benytter oss av en rekke genomiske analyser, der vi ser på mutasjons-status både på enkeltgener og på hele exomet, uttrykkingsnivå av enkeltgener (qPCR) og tusenvis av gener på en gang (microarray). DNA og RNA ekstraksjonen, vanlig PCR, qPCR og mesteparten av resultatanalysene utfører vi selv. Mikroarrayene utføres av instituttets kjernefasilitet, mens exomsekvenseringen utføres av kjernefasilitetet på Radiumhospitalet.
Proteomikk:
V i benytter kvantitativ massespektrometri-basert proteomikk for å identifisere og kvantifisere proteinene i spesifikke prøvematerialer (f.eks. cellelysat fra PBMCer fra AML pasienter, eller supernatanter fra celledyrkningsoppsett). Ved å sammenlikne proteinprofiler (proteomet) mellom to ulike pasientgrupper (f.eks. pasienter med og uten tilbakefall), ønsker vi å finne potensielle biomarkører relatert til fenotypen. Ofte benytter vi «shotgun proteomikk», som involverer proteolytisk nedbrytning av proteiner til peptider, og separering av peptid-fragmentene v.h.a. væskekromatografi, etterfulgt av massespektrometrisk analyse av prøver med eller uten en intern standard. Vi benytter vår samarbeidspartner, Proteomikkenheten ved Universitetet i Bergen (PROBE), sine massespektrometre, Orbitrap Elite og Q Exactive HF, og bruker flere bioinformatiske verktøy for å produsere meningsfylt biologisk informasjon ut av rådataene som instrumentene genererer.
Seahorse:
Med Seahorse XFe96 analysatoren måler vi oksygen konsumsrate (OCR) og raten på ekstracellulær forsuring (ECAR) i levende celler dyrket i 96-brønns plater. Dette gir dermed mulighet for å undersøke mitokondriell respirasjon og glykolyse aktivitet i cellene. Ved å måle OCR og ECAR får vi en forståelse av den metabolske funksjonen hos de dyrkede cellene på et systemisk nivå. Instrumentet eies av vår samarbeidspartner Bioingeniørutdanningen ved Høyskolen på Vestlandet (HVL), og er lokalisert hos dem.
